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滬鼎生物科技小鼠胃動素(MTL)試劑盒操作流程

發布時間:2022-03-28 點擊量:70

【預期用途】

僅供科研使用,本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關液體樣本中胃動素(MTL)含量。


【檢測原理】

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠胃動素(MTL)水平。用純化的小鼠胃動素(MTL)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入胃動素(MTL),再與HRP標記的胃動素(MTL)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胃動素(MTL)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中小鼠胃動素(MTL)濃度。 

【操作步驟】

1.標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

圖片1.png

480pg/ml5號標準品150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

240pg/ml4號標準品150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

120pg/ml3號標準品150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

60pg/ml2號標準品150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

30pg/ml1號標準品150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

6.加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。 

7.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

8.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

11.測定:以空白孔調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

注意:

1.試劑準備:試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。準備一次實驗所需要的酶標條,其它的可從微孔板上拆下,密封,按照說明書要求保存,以備下次使用。

2.加樣:實驗操作中請使用一次性的滅菌吸頭,避免污染。加樣時注意不要有氣泡產生,將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。與反應試劑加入一樣,加樣過程中第一個孔與最后一個孔加樣時間間隔盡量?。ㄒ话憧刂圃?0 分鐘以內),如果太大,將會導致不同的“預溫育"時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。為了測值的準確性,推薦設置復孔進行實驗。

3.溫育:為防止樣品蒸發,實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內,以避免液體蒸發,洗板后應盡快進行下步操作,任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態,同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4.洗滌:濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。充分洗滌非常重要,在每次洗滌過程中,都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔內殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干,勿將吸水紙直接放入反應孔中吸水,同時要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印,避免影響最后的酶標儀讀數。如果使用自動洗板機,請在熟練使用后再用于正式實驗過程中。

5.反應時間的控制:加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化,如觀察到顏色較深,請提前加入終止液終止反應,避免反應過強而影響酶標儀光密度讀數。

6.底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。

【結果計算】

  以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。 

圖片2.png


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